細(xì)胞培養(yǎng)基的生產(chǎn)和過程控制，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測

1細(xì)胞培養(yǎng)基的生產(chǎn)和過程控制
 

細(xì)胞培養(yǎng)基作為生物制品生產(chǎn)的重要原材料之一，其質(zhì)量對(duì)生物制品有重要的影響。細(xì)胞培養(yǎng)基的生產(chǎn)工藝和細(xì)胞培養(yǎng)基的原材料選用、生產(chǎn)過程及檢驗(yàn)過程中的質(zhì)量控制對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)基的產(chǎn)品質(zhì)量具有直接影響。其中原材料的成份及其質(zhì)量直接決定了細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的質(zhì)量及安全性，選擇合適的物料是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)基功能過程中需要解決的基礎(chǔ)問題。生產(chǎn)工藝的選擇（如原料的研碎、混合技術(shù)等）及生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制等直接影響產(chǎn)品的溶解性、批生產(chǎn)量及批次間差異，進(jìn)而影響產(chǎn)品的質(zhì)量。
 

cGMP稽查員在對(duì)國內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行cGMP審計(jì)時(shí)指出，細(xì)胞培養(yǎng)基的生產(chǎn)工藝及設(shè)備應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證，原材料必須做鑒別試驗(yàn)，記錄應(yīng)真實(shí)反映生產(chǎn)過程的實(shí)際情況，生產(chǎn)過程偏差處理應(yīng)包括對(duì)出現(xiàn)偏差之前涉及到的批次均應(yīng)進(jìn)行調(diào)查等等。這些要求是基于FDA對(duì)生物制藥用原料的質(zhì)量要求方面提出，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國內(nèi)對(duì)藥用原料的要求。隨著對(duì)人用和動(dòng)物保健用生物制品安全性要求的提高，嚴(yán)格執(zhí)行GMP規(guī)范進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)是國內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。

 

1.1細(xì)胞培養(yǎng)基的原料選擇及質(zhì)量控制
 

1.1.1原材料的選擇

由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品屬于藥用原料，《哺乳類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的微生物限度、內(nèi)毒素含量進(jìn)行了限定，所以細(xì)胞培養(yǎng)基所用原料宜采用注射級(jí)、藥用級(jí)原料。對(duì)于部份沒有注射級(jí)和藥用級(jí)的原料，細(xì)胞培養(yǎng)基制造者針對(duì)自身產(chǎn)品質(zhì)量要求，制定一些重要指標(biāo)（微生物限度、內(nèi)毒素、重金屬等）進(jìn)行原材料的質(zhì)量控制。
 

1.1.2原材料的質(zhì)量控制

細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)建立完善的原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于原材料的來源、檢驗(yàn)、使用、及銷毀等有明確的可追溯記錄。在質(zhì)量控制過程中，藥用級(jí)原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)參考中國藥典相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于非藥用級(jí)原材料應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)工藝需要與供應(yīng)商一起共同確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括如下內(nèi)容：

¨      指定的物料名稱和企業(yè)內(nèi)部使用的物料代碼

¨      藥典專論的名稱（如有）

¨      經(jīng)批準(zhǔn)的供應(yīng)商以及原始生產(chǎn)商

¨      印刷包裝材料的樣張

¨      物料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)及其編號(hào)

¨      取樣、檢驗(yàn)方法或相關(guān)規(guī)程編號(hào)

¨      定性和定量的限度要求

¨      貯存條件和注意事項(xiàng)

¨      復(fù)驗(yàn)前的最長貯存期
 

原材料的質(zhì)量檢測主要從材料、人員、方法三個(gè)方面進(jìn)行控制：

1)    具有必要的檢測試劑、設(shè)備和設(shè)施，如鱟試劑、分析天平、潔凈操作室或取樣柜。

2)    擁有相應(yīng)操作資質(zhì)和能力的檢驗(yàn)人員，如相應(yīng)檢測人員應(yīng)具備化驗(yàn)員資質(zhì)并經(jīng)過全面的技能培訓(xùn)。

 選擇具有法律效力的檢測方法以及對(duì)應(yīng)的操作規(guī)范，在檢測方法的選擇方面藥用原料應(yīng)優(yōu)先采用藥典方法，非藥用原料應(yīng)采用經(jīng)過驗(yàn)證有效的檢測方法，在確定檢測方法后應(yīng)制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)操作文件，用于規(guī)范試驗(yàn)操作。
 

應(yīng)嚴(yán)格控制細(xì)胞培養(yǎng)基的原材料質(zhì)量管理，并建立相應(yīng)完善的原材料質(zhì)量管理文件體系。原材料的質(zhì)量管理方面，應(yīng)明確規(guī)定責(zé)任范圍和流程方法，它們是保證原材料質(zhì)量的基礎(chǔ)。原材料質(zhì)量管理文件體系內(nèi)容通常包括兩個(gè)方面，一方面是明確原材料質(zhì)量責(zé)任應(yīng)歸屬的部門及人員，以實(shí)現(xiàn)分工明確；另一方面是明確原材料的取樣、檢驗(yàn)、放行、判定不合格、異常情況、偏差、驗(yàn)證等事務(wù)具體流程，確保流程正確，方法無誤，為質(zhì)量控制提供依據(jù)。

 

1.2細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)工藝

 

       傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)工藝即生產(chǎn)過程通常分為物料配比、物料干燥、物料研碎、物料混合、物料包裝、成品的檢驗(yàn)等6個(gè)階段，下面結(jié)合過程中的質(zhì)量控制對(duì)此工藝進(jìn)行介紹：

 

1.2.1物料配比

 

      物料配比是根據(jù)配方要求將各種原料按比例配制的過程。配制需嚴(yán)格執(zhí)行配方，才能保證細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品功能的實(shí)現(xiàn)及降低批間差，而實(shí)現(xiàn)低誤差的物料配比過程需從以下幾個(gè)方面進(jìn)行控制：

 

1)   提供與生產(chǎn)工藝規(guī)程匹配且經(jīng)過審核的、有效力的物料配方，生產(chǎn)部門根據(jù)配方制定配比操作記錄，經(jīng)質(zhì)量管理部門審核后，方可投入生產(chǎn)作業(yè)使用；

 

2)   具有詳細(xì)明確的經(jīng)過驗(yàn)證的設(shè)備、設(shè)施、工序操作規(guī)程以及相關(guān)管理規(guī)程，如通過編制設(shè)備、設(shè)施的驗(yàn)證、使用、維護(hù)、維修操作規(guī)程來明確操作方法和流程，通過編制相應(yīng)管理文件，來明確人員責(zé)任；

 

3)   具有足夠的在校驗(yàn)有效期內(nèi)的精確度合理的計(jì)量器具，及與產(chǎn)品質(zhì)量要求相匹配的生產(chǎn)環(huán)境設(shè)施，如為降低細(xì)胞培養(yǎng)基微生物、內(nèi)毒素限度使用潔凈廠房進(jìn)行生產(chǎn)等；

 

4)   足夠的經(jīng)過合理培訓(xùn)具有上崗資質(zhì)的操作人員和設(shè)備管理人員（操作員上崗證、計(jì)量員證），各崗位操作人員配備足夠，能夠確保操作過程實(shí)現(xiàn)雙人操作雙人復(fù)核；

 

5)   配備足夠的基層管理人員以及現(xiàn)場QA，起到指導(dǎo)和監(jiān)督作用。

 

1.2.2物料干燥

 

       基于細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品營養(yǎng)豐富，且不是無菌制劑的特性，為避免微生物滋生破壞細(xì)胞培養(yǎng)基成份，需控制細(xì)胞培養(yǎng)基中的水分含量，依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求，其干燥減重質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)低于5.0%，而原料干燥是控制其含水量的最重要環(huán)節(jié)。

 

       目前常用的干燥方法有常壓干燥和冷凍干燥。常壓干燥包括烘干干燥、鼓式干燥、帶式干燥，由于國內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家普遍采用球磨缸進(jìn)行生產(chǎn)，由于各缸獨(dú)立，無法使用鼓式干燥、帶式干燥的方式進(jìn)行連續(xù)烘干作業(yè)，所以普遍采用烘干干燥的方式按批進(jìn)行物料干燥。冷凍干燥主要用于不能耐受高溫的貴細(xì)物料的干燥處理。

 

1.2.3物料研磨

 

       細(xì)胞培養(yǎng)基顆粒越細(xì)，同質(zhì)條件下比表面積越大，其溶解性越好，而其成品細(xì)度是由物料的研磨過程直接決定。對(duì)于物料的研磨，傳統(tǒng)普遍采用藥用球磨機(jī)，其主要優(yōu)點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、易于清潔及使物料混合作用（能夠?qū)崿F(xiàn)缸體內(nèi)各種成份的均勻分布）。球磨缸內(nèi)的研磨球材質(zhì)通常有陶瓷、瑪瑙、不銹鋼（304或316L）。但是球磨機(jī)也存在批量小、噪音大、難以控制溫度、粉狀物料不易取出且取料過程會(huì)產(chǎn)生大量粉塵等缺點(diǎn)。目前國內(nèi)一些細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)在球磨缸取料工序裝備了全密閉自動(dòng)取粉裝置，較好的解決了粉塵污染問題，也進(jìn)一步降低了由于物料的裸露可能帶來的引入異物及物料受潮的風(fēng)險(xiǎn)。

 

1.2.4物料混合

 

       混合設(shè)備首先必須具備能夠?qū)崿F(xiàn)物料均勻性的功能。在上述物料研磨過程中，可能存在投料微量誤差、過程參數(shù)細(xì)微差異以及其他不可控因素，上述因素的累積會(huì)導(dǎo)致不同研磨單元內(nèi)物料可能出現(xiàn)一定的差異（外觀、理化性質(zhì)、培養(yǎng)性能），這些差異將直接影響產(chǎn)品的使用，造成使用者生產(chǎn)效率及產(chǎn)品的批間差異。根據(jù)哺乳類細(xì)胞培養(yǎng)基行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于“批”的定義，即同一臺(tái)混合設(shè)備一次混合量所生產(chǎn)的均質(zhì)產(chǎn)品為一批，物料經(jīng)研磨單元研磨以后必須進(jìn)行總混和均勻后才能稱為一批成品進(jìn)行包裝。目前常用的物料混合設(shè)備以摻和機(jī)、雙錐混合機(jī)較為常見。

 

1.2.5物料包裝

 

       物料的包裝分為內(nèi)包裝和外包裝，主要為了實(shí)現(xiàn)如下功能：

 

1)   阻隔性功能：即密閉保存（避光、防潮、防污染、防氧化等），是指直接與產(chǎn)品接觸的內(nèi)包裝，在選擇內(nèi)包裝材料時(shí)其阻隔性是關(guān)鍵，高阻隔性包裝薄膜所采用的阻隔性樹脂主要有EVOH、PA、PET、PVDC、PC、MXD6和聚丙烯腈共聚物，其中PVDC是開發(fā)較早的阻隔性能優(yōu)異的材料，而包裝用薄膜材料結(jié)構(gòu)包括：紙／塑料、塑料／鍍鋁塑料、紙／鋁箔／塑料和塑料／鋁箔／塑料等幾種【11】；

 

2)   產(chǎn)品信息的提供：產(chǎn)品外包裝上應(yīng)明確標(biāo)識(shí)品名、批號(hào)、代碼、生產(chǎn)日期、有效期、使用方法等基礎(chǔ)信息，并隨附企業(yè)質(zhì)量監(jiān)管部門下發(fā)的產(chǎn)品合格證以及質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告等質(zhì)量證明文件；

 

3)   易于運(yùn)輸?shù)姆雷o(hù)：確保外包裝物能夠抵御運(yùn)輸過程中裝卸產(chǎn)生撞擊的沖擊，并要具備一定的堆疊強(qiáng)度，對(duì)于需要遠(yuǎn)途運(yùn)輸?shù)牟荒苣褪芨邷氐某善窇?yīng)做好低溫保護(hù)工作（填充保溫材料，包裝箱內(nèi)混裝冰袋、干冰等蓄冷物）。

 

1.2.6成品的檢驗(yàn)

 

細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品生產(chǎn)完畢后，由質(zhì)量檢測部門對(duì)該批次產(chǎn)品進(jìn)行檢測，在這一周期內(nèi)，成品處于待驗(yàn)狀態(tài)，儲(chǔ)存條件應(yīng)與合格成品一致，應(yīng)專區(qū)存放專人管理，避免混淆和遺漏，在收到質(zhì)量檢測部門檢測合格予以放行的通知后，轉(zhuǎn)交成品庫，移入合格品區(qū)備售。

 

1.2.7細(xì)胞培養(yǎng)基生產(chǎn)的新工藝

 

采用上述傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝（通常稱作球磨工藝）生產(chǎn)的產(chǎn)品均一性較好，物化性能穩(wěn)定以及細(xì)胞培養(yǎng)效果較好，但是存在批量小、研磨過程中的散熱難以控制、噪音及粉塵污染較大等缺點(diǎn)。2005年新開發(fā)了一種連續(xù)生產(chǎn)的針式研磨系統(tǒng)（pin mill），集“物料混合－針式研磨－研磨后混合”一體，用于工業(yè)化生產(chǎn)干粉細(xì)胞培養(yǎng)基，可以用來生產(chǎn)從10kg至4000kg不等批量的干粉細(xì)胞培養(yǎng)基。

 

Pin mill研磨系統(tǒng)是一種高速?zèng)_擊研磨系統(tǒng)，包括一個(gè)進(jìn)料口、兩個(gè)同軸帶有研磨針的轉(zhuǎn)盤以及一個(gè)出料口。當(dāng)原料通過進(jìn)料口投入研磨器后到達(dá)轉(zhuǎn)盤中央，在轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)離心力的推動(dòng)下往徑向外側(cè)運(yùn)動(dòng)同時(shí)被相互咬合且相對(duì)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的研磨針研細(xì)。物料在進(jìn)入針式研磨腔前和完成研磨離開研磨設(shè)備后都使用混合機(jī)進(jìn)行了混合，以確保進(jìn)入研磨器和最終產(chǎn)品的成份均勻性，其生產(chǎn)工藝流程見下圖1-1。


 

圖1-1 pin mill生產(chǎn)干粉細(xì)胞培養(yǎng)基工藝流程圖

 

與傳統(tǒng)的球磨生產(chǎn)工藝相比，pin mill 生產(chǎn)系統(tǒng)研磨的顆粒更細(xì)，批次控制范圍大且靈活（0.5~4000kg），在研磨及研磨后顆粒輸送的過程中，采用氮?dú)饪刂茩C(jī)體的溫度，使研磨機(jī)的溫度保持在40℃以下，并且避免了粉塵污染、交叉污染等。該系統(tǒng)機(jī)體的拆分、組裝及清潔也較為簡單，適合cGMP生產(chǎn)。

 

關(guān)于使用pin mill 系統(tǒng)生產(chǎn)的DPM性能，如生產(chǎn)過程中的成份組成均質(zhì)性、生產(chǎn)的產(chǎn)品性能及是否適合細(xì)胞培養(yǎng)和生物制品生產(chǎn)等，有詳細(xì)的驗(yàn)證研究，結(jié)果顯示，pin mill生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品均勻分布性滿足標(biāo)準(zhǔn)，并且均勻性與成份以及批量大小無關(guān)；生產(chǎn)的產(chǎn)品諸如溶解性、pH、滲透壓等理化性質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)方面及生物制品生產(chǎn)與球磨生產(chǎn)工藝相同。