滲透壓對CHO細胞生長、細胞體積、抗體產(chǎn)率及糖基化的影響

1、介紹

中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的培養(yǎng)滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）和細胞體積與特定的重組蛋白生產(chǎn)力相關，生物合成能力和營養(yǎng)交換取決于細胞大小，而細胞大小又受到培養(yǎng)物滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的影響，已知高滲條件會導致細胞體積增加。

細胞大小是特定蛋白質(zhì)生產(chǎn)力的決定因素。盡管每個細胞周期階段的細胞都具有生產(chǎn)力，但G2/M期的細胞表現(xiàn)出最高的生產(chǎn)力。
在某些研究中，滴度的增加伴隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量的變化，特別是在糖基化方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）可以降低Fc融合蛋白的N-糖中酸性異構體和唾液酸含量的比例，這可以通過添加甜菜堿來避免。
同樣，在補料分批培養(yǎng)階段，滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）濃度增加60-120mOsm/kg會導致未充分加工的聚糖的分泌。

2、結果和討論

一、高滲透壓對細胞生長和代謝的影響

圖1：中國倉鼠卵巢（CHO）細胞的最大生長速率與細胞外滲透壓的函數(shù)關系。

我們在接種前向培養(yǎng)基中加入NaCl或補料C，以獲得320至500 mOsm kg?1之間的初始滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）值。如圖1所示，在這兩種情況下，滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的增加導致最大特定細胞生長率顯著降低。兩種處理方式的最大生長率差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。

不同滲透壓條件下細胞培養(yǎng)參數(shù)隨時間的變化曲線

活細胞密度曲線如圖2A所示隨著鹽或補料的添加滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）濃度增加，生長速率明顯降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，添加補料會嚴重抑制細胞生長，在（添加補料C）滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）達到500 mOsm kg?1的情況下可以清楚地看到這一點。在培養(yǎng)過程中，滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）值增加（圖2B），主要是由于細胞外乳酸、Na+和K+的積累（圖2，分別為E、G和H）。

直到第5天，平均細胞直徑與滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）呈正相關（圖2C），其值在接種后24小時快速增加，特別是對于添加補料C超過410 mOsm kg?1與對照組相比非常明顯。然而，從第6天開始，當對照和添加NaCl的培養(yǎng)物中的葡萄糖和谷氨酸等關鍵營養(yǎng)物質(zhì)開始耗盡時，趨勢發(fā)生了變化（圖2F、2I）。

氨濃度(圖2D)呈逐漸增加的趨勢，但只有3種條件超過5mM，對該細胞系[36]有明顯的抑制作用。然而，在所有情況下，這一閾值是在靜止期或后期培養(yǎng)，很可能不損害達到高峰細胞密度。圖2E，F分別顯示細胞外乳酸菌和葡萄糖的分布，其中前者從產(chǎn)生到消耗的轉變僅在對照和320mOsmkg-1條件下進行。其余的培養(yǎng)物在整個培養(yǎng)過程中表現(xiàn)出持續(xù)的乳酸產(chǎn)生，在一些添加NaCl的培養(yǎng)物中，乳酸似乎來自葡萄糖以外的其他來源。從乳酸產(chǎn)生到消耗的轉變被認為取決于培養(yǎng)液的pH值。

圖3 不同滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）條件下（A）氨、（B）葡萄糖、（c）谷氨酸、（D）谷氨酰胺和（E）乳酸的特定攝取/產(chǎn)生速率。對照培養(yǎng)物未產(chǎn)生可檢測水平的谷氨酰胺。誤差條表示兩個平行實驗的標準偏差。對于顯著性分析（*p<0.05），假設不同實驗之間每個變量的方差相等.

圖3顯示了指數(shù)生長階段（即根據(jù)第0天至第6天的數(shù)據(jù)計算）我們觀察到了恒定的滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）值。與對照組相比，所有培養(yǎng)物的特定葡萄糖消耗率都較高，盡管表現(xiàn)出較低的特定細胞生長率。無論隨后的高滲處理如何，隨著滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的增加，葡萄糖上的乳酸產(chǎn)量都更高，這表明無論誘導方法如何，碳代謝都不充分。先前已經(jīng)報道，在較高的殘留葡萄糖濃度下，葡萄糖上的乳酸產(chǎn)量增加。事實上，我們的實驗結果指向相同的表型。比較使用相同誘導方法的培養(yǎng)物之間的殘留葡萄糖濃度（圖2F），我們發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度越高，在細胞生長期（兩天的初始適應期，隨后是指數(shù)細胞生長）內(nèi)乳酸的產(chǎn)生率就越高（圖3E）。這種行為在培養(yǎng)后期仍在繼續(xù)，在正常滲透壓條件下（對照和370mOsm kg?1 NaCl）的兩種培養(yǎng)物顯示出乳酸濃度的快速下降，這是由于細胞將代謝產(chǎn)物作為碳源重新內(nèi)化所致（圖2E）。在加入NaCl的最高滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）培養(yǎng)物的情況下，產(chǎn)生的乳酸鹽的一部分似乎來自糖酵解以外的來源。先前有報道稱，谷氨酸解酶可以在癌癥細胞中提供碳和氮，已知這些細胞與CHO細胞具有相似的代謝特征。有趣的是，當滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）值在410-420mOsm kg?1范圍內(nèi)時，在兩種高滲誘導策略下，氨的產(chǎn)生率沒有顯著差異。然而，這種變化在460–470 mOsm kg?1范圍內(nèi)，其中NaCl培養(yǎng)物表現(xiàn)出顯著更高的氨生成率（p<0.05）。具體而言，添加NaCl的培養(yǎng)物比添加補料C的實驗分泌更多的氨（圖3A）。這與各自的谷氨酰胺生產(chǎn)速率一致，后者使用氨合成和分泌谷氨酰胺的速率高于前者（圖3D）。然而，谷氨酸的攝取/生產(chǎn)速率并不遵循相同的模式，460–470 mOsm kg?1范圍內(nèi)的NaCl培養(yǎng)物消耗谷氨酸，而補料C培養(yǎng)物分泌谷氨酸。鑒于補料C富含氨基酸，我們假設這些培養(yǎng)物將其他氨基酸轉化為谷氨酸，然后用于合成谷氨酰胺。有趣的是，500 mOsm kg?1的培養(yǎng)物表現(xiàn)不同，表現(xiàn)出氨和谷氨酸產(chǎn)量增加，谷氨酰胺分泌減少，表明在這些高滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）、營養(yǎng)豐富的條件下有不同的代謝途徑。

二、高滲壓對滴度和特異性抗體生產(chǎn)率及糖基化的影響

圖4顯示了所有培養(yǎng)物收獲時的mAb滴度和各自的整體活細胞密度（IVCD）值。最高滴度為410 mOsm kg?1，添加補料C也顯示出最高的IVCD，盡管后者與對照培養(yǎng)物沒有顯著差異。在另一端，500 mOsm kg?1補料C培養(yǎng)物的IVCD和mAb滴度最低�？偟膩碚f，滴度大致遵循與IVCD相同的趨勢，470 mOsm kg?1 NaCl培養(yǎng)物除外。從圖5中的特定mAb生產(chǎn)力我們可以看到，在所有條件下，470 mOsm kg?1 NaCl培養(yǎng)物的mAb分泌率最高。這不僅高于對照培養(yǎng)物，而且明顯高于所有添加補料C培養(yǎng)物。有趣的是，補充NaCl的培養(yǎng)物顯示出特定mAb生產(chǎn)力的增加，這與滲透壓值呈正相關，而添加補料C的培養(yǎng)物在三種不同的滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）值之間沒有統(tǒng)計學上的顯著差異。這可能源于后一種培養(yǎng)物由于葡萄糖豐度高，對營養(yǎng)物質(zhì)的利用效率較低。此外，470 mOsm kg?1 NaCl和410 mOsm kg?1補料C培養(yǎng)物在第6天后表現(xiàn)出明顯更大的細胞直徑，如圖2C所示。

兩種高滲誘導方法對收獲時mAb糖基化的影響如圖6所示。在添加NaCl的培養(yǎng)物中，聚糖分布沒有統(tǒng)計學上的顯著差異（p>0.05）。然而，添加更多補料C的培養(yǎng)物顯示，隨著滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的增加，G0F下降（410和500 mOsm kg?1之間的差異為18%）。這伴隨著G0的增加（410和500 mOsm kg?1之間的差異為10%）和半乳糖基化百分比的較小增加（G1F、G10F和G2F）。然而，毫不奇怪，表現(xiàn)出最高物種生產(chǎn)力（410 mOsm kg?1補料c）的培養(yǎng)物也顯示出非半乳糖基化的百分比增加。另一方面，抗體合成和分泌的高速率可能限制了抗體在高爾基體中的停留時間，因此降低了負責mAb半乳糖基化的b-1,4-半乳糖基轉移酶（b4GalT）對聚糖的進一步加工程度。與預期的非半乳糖基化結構的分布增加相反，核心巖藻糖基化在培養(yǎng)物中表現(xiàn)出意想不到的行為，包括添加補料C以調(diào)節(jié)滲透壓。如圖6所示，最高滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）條件（500 mOsm kg?1補料C）的核心巖藻糖基化水平明顯低于410 mOsm kg?1補料C樣品（p<0.05），盡管其特異性抗體生產(chǎn)率較低。上述觀察結果可能表明，由于較高的滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）水平，a-1,6-巖藻糖基轉移酶（FucT）酶活性受到抑制或基因（Fut8）表達減少，假設核心巖藻糖化的共底物GDP巖藻糖的水平不受滲透壓變化的影響。

三、高滲透壓對細胞體積的影響

在研究了CHO細胞培養(yǎng)開始時添加補料和鹽誘導的高滲性的影響后，我們在生物反應器中觀察了一組典型的補料CHO細胞。后者更好地代表了典型的生產(chǎn)條件，在這種條件下，由于營養(yǎng)物質(zhì)的補充和代謝物的產(chǎn)生，細胞外滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）比初始值增加了70%，此前有報道稱，這會導致細胞體積增加四倍。此外，在生物反應器環(huán)境中，我們可以有效地控制培養(yǎng)物的pH，但也可以探索在指數(shù)生長期間將溫度轉移到溫和低溫條件的影響，這是延長培養(yǎng)時間和提高產(chǎn)品滴度的常用策略。在我們的生物反應器研究中，代謝在36.5℃時更活躍、 其中葡萄糖和乳酸兩者比在亞低溫下更容易被消耗。這導致滲透壓摩爾濃度在36.5時緩慢增加，用于相同的補料計劃（圖7a）。將平均細胞大小繪制為滲透壓濃度的函數(shù)，說明了滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）濃度對細胞體積的影響（圖7b）。

結果

在CHO細胞的Fed-Batch培養(yǎng)模式下，補料的添加和代謝產(chǎn)物的積累導致后期培養(yǎng)液物中細胞外滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的增加。
通過NaCl調(diào)節(jié)滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）至470 mOsm/kg時對抗體產(chǎn)率和滴度具有促進作用，但是通過補加Feed C提高了mAb產(chǎn)率，但細胞生長速率顯著降低且導致半乳糖基化水平比例顯著降低。

3、結論

在本研究中，我們檢測了高滲條件對CHO細胞生長、細胞體積和抗體產(chǎn)生的影響。我們比較了兩種誘導高滲性的方法，添加NaCl和添加補料C。滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）對細胞生長和抗體滴度的影響程度差異很大，取決于滲透壓的值以及增加滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）的方法。這是因為，盡管高滲條件在所有條件下都提高了特定抗體的生產(chǎn)力，但它們也對生長產(chǎn)生了不利影響，這意味著在某些情況下總滴度低于對照。令人驚訝的是，與補充補料C的培養(yǎng)物相比，補充NaCl的培養(yǎng)物表現(xiàn)出更一致的行為，這表明過量營養(yǎng)物添加對生長速率的不利影響。