高滲乳酸鈉改善膿毒癥大鼠模型的微循環(huán)、心功能和炎癥

摘要

（1）背景：

高滲乳酸鈉（HSL）可能在炎癥過(guò)程中起作用。我們旨在評(píng)估其在大鼠實(shí)驗(yàn)性膿毒癥（盲腸結(jié)扎穿刺（CLP））期間的作用。

（2）方法：

分三組（n=10/組）：假手術(shù)組、CLP-NaCl 0.9%和CLP-HSL（CLP后2.5ml/kg/h液體18小時(shí)）。評(píng)估腸系膜微循環(huán)、超聲心動(dòng)圖、細(xì)胞因子和生化參數(shù)。對(duì)毛細(xì)血管滲漏（Evans blue，n=5/組）和心臟血流動(dòng)力學(xué)（n=7/組）進(jìn)行了另外兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

（3）結(jié)果：

HSL改善了腸系膜微循環(huán)、心輸出量和左心室短縮分?jǐn)?shù)。HSL還提高了dP/dtmax斜率，降低了左室舒張末壓-容積關(guān)系，并減少了腸道、肺和肝臟中的伊文思藍(lán)擴(kuò)散。乳酸和3-羥基丁酸在CLP-HSL中較高。HSL患者的血漿細(xì)胞因子（IL-1β，TNFα，IL-10）以及血漿VEGF-A減少。

（4）結(jié)論

高滲乳酸鈉液可預(yù)防膿毒癥時(shí)的心功能不全、腸系膜微循環(huán)改變和毛細(xì)血管滲漏，同時(shí)減少炎癥并增強(qiáng)酮體。

Material and methods

前站、隨機(jī)、對(duì)照的研究設(shè)計(jì)及倫理

動(dòng)物程序

主要目的是比較HSL和0.9%NaCl對(duì)微循環(huán)的影響�；�先前的數(shù)據(jù)[21]，我們預(yù)先計(jì)算了每組10只雄性Sprague-Dawley大鼠（400-500g）的數(shù)量，足以確定微循環(huán)流量差異20%，α風(fēng)險(xiǎn)為5%，效能為90%。次要目標(biāo)是心功能、毛細(xì)血管滲漏、炎癥和代謝。由于與微循環(huán)研究不兼容，其中一些目標(biāo)需要額外的動(dòng)物。根據(jù)我們之前的經(jīng)驗(yàn)，Evans blue和壓力-容積回路分別為每組5只動(dòng)物和7只動(dòng)物。

實(shí)驗(yàn)流程

通過(guò)盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）誘導(dǎo)膿毒癥。通過(guò)腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪（75/5mg/kg）麻醉動(dòng)物。將3-F聚氨酯灌注導(dǎo)管插入右頸靜脈。結(jié)扎盲腸（占盲腸體積的75%）并刺穿盲腸（16克針頭）以使糞便外部化。在手術(shù)結(jié)束時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分為四組：接受11.2%乳酸鈉的CLP-HSL（1000 mmol/L鈉+1000 mmol/L乳酸鈉，法國(guó)APHP），接受0.9%NaCl的CLP-NaCl（154 mmol/L氯+154 mmmol/L鈉），接受8.4%碳酸氫鈉的CLP-HSB（1000 mmmol/L碳酸氫鈉+1000 mm/L鈉），假手術(shù)采用宮頸切開(kāi)術(shù)和剖腹術(shù)，但不使用導(dǎo)管/CLP。不幸的是，HSB組6只大鼠中只有2只存活。出于道德原因，并根據(jù)為本研究提供的合法授權(quán)，我們未完成本組研究。CLP大鼠無(wú)法獲得水和食物，并接受了18小時(shí)內(nèi)2.5毫升/千克/小時(shí)的研究液體輸注。向CLP-NaCl溶液中添加8%的叔丁基葡萄糖，以產(chǎn)生與CLP-HSL組相同的熱量[20]。實(shí)驗(yàn)中的大鼠被單獨(dú)關(guān)在籠子里。在使用氯胺酮/甲苯噻嗪（75/5 mg/kg）麻醉后，實(shí)現(xiàn)了三組不同的實(shí)驗(yàn)：（1）超聲心動(dòng)圖和激光斑點(diǎn)成像（n=10/組），（2）伊文思藍(lán)測(cè)定（n=5/組），或（3）壓力-容積回路（n=7/組）。

（1）超聲心動(dòng)圖

在麻醉下實(shí)現(xiàn)超聲心動(dòng)圖，并使用M模式測(cè)量左室舒張末期和收縮末期直徑（LVEDD和LVESD），從而計(jì)算左室縮短分?jǐn)?shù)（LVFS）。脈沖波多普勒用于采集和計(jì)算二尖瓣E/A比。通過(guò)近端肺動(dòng)脈測(cè)量每克動(dòng)物的心輸出量。

（2）腸系膜灌注

超聲心動(dòng)圖檢查后，通過(guò)激光斑點(diǎn)對(duì)比成像對(duì)腸道進(jìn)行微循環(huán)采集。在遠(yuǎn)離空腸部位的四個(gè)相似感興趣區(qū)域?qū)崿F(xiàn)圖像分析，平均值表示為灌注單位（PU）。

（3）毛細(xì)血管滲漏和伊文思藍(lán)測(cè)定

靜脈注射伊文思藍(lán)，45分鐘后用多聚甲醛將其從血流中沖洗掉。心臟（左心室）、肺、腸道和肝臟樣品在60°C下脫水5天，然后在37°C下在10%甲酰胺中孵育3天。使用分光光度法在620nm處測(cè)量離心上清液的吸光度。

在CLP-NaCl和CLP-HSL組中記錄液體平衡（尿量和輸注液體之間的差異）。

（4）血流動(dòng)力學(xué)

獲得左心室（LV）的壓力-容積環(huán)和血流動(dòng)力學(xué)。記錄/計(jì)算左室收縮壓（LVESP）、左室舒張壓（LVEDP）、dP/dtmin、dP/dtmax和左室舒張常數(shù)tau（Weiss法）。計(jì)算LVESP和LVEDP關(guān)系（LVESPVR和LVEDPVR），作為負(fù)荷無(wú)關(guān)的左室收縮功能和左室順應(yīng)性的指標(biāo)。在程序結(jié)束時(shí)采集血樣，使用冷凍滲透壓計(jì)測(cè)量和比較血漿滲透壓（mosmol/kg）。

（5）生物學(xué)參數(shù)

在手術(shù)結(jié)束時(shí)，采集最大體積的血液。

（6）炎癥和毛細(xì)血管滲漏相關(guān)標(biāo)志物

IL-1β、TNFα和IL-10；使用ELISA測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A型（VEGF-A）和syndecan-1。

（7）生物化學(xué)

　　在血液和尿液中測(cè)量尿素、鈉、鉀和氯化物。在血液中測(cè)量白蛋白。計(jì)算實(shí)驗(yàn)期間排出的離子的絕對(duì)量，計(jì)算整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間注入的離子量和排出的離子量之間的差異，并反映出在輸注期間體內(nèi)過(guò)量的離子。

（8）新陳代謝

測(cè)定血糖、乳酸、丙酮酸、3-羥基丁酸和乙酰乙酸的血含量。

（9）統(tǒng)計(jì)分析

使用達(dá)戈斯蒂諾檢驗(yàn)評(píng)估數(shù)據(jù)分布，數(shù)據(jù)以四分位間距[IQ1–IQ3]或標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SD）的均值表示。根據(jù)分布的正態(tài)性，使用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal Wallis或Mann-Whitney）或參數(shù)檢驗(yàn)（ANOVA或t-Student）實(shí)現(xiàn)組間比較，如果結(jié)果顯著，則使用Dunn或Holm-Sidak的多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行事后分析。實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)比較：CLP-NaCl組與假手術(shù)組和CLP-NaCl組與CLP-HSL組。因?yàn)槲覀冎荚谠u(píng)估HSL在膿毒癥期間的作用，所以sham和CLP-HSL之間的比較并不相關(guān)，可能會(huì)降低分析的能力。所有比較均使用Prism v8.0（美國(guó)GraphPad）實(shí)現(xiàn)。p<0.05被認(rèn)為是顯著的。如果缺少關(guān)于每組實(shí)驗(yàn)次要終點(diǎn)的數(shù)據(jù)，則應(yīng)用對(duì)照組的中值來(lái)支持無(wú)效假設(shè)。

結(jié)果

在每組22只大鼠中（3組實(shí)驗(yàn)），CLP-HSL組2只和CLP-NaCl組1只在灌注結(jié)束前死亡（補(bǔ)充新大鼠）。

（1）腸系膜灌注

與假手術(shù)組相比，CLP-NaCl組的腸系膜灌注平均值顯著降低（286±129對(duì)957±169 PU，p<0.0001）。相反，與氯化鈉相比，HSL顯著增強(qiáng)了CLP大鼠的灌注（712±366對(duì)286±129 PU，p=0.0006，圖1）。

圖1. 激光散斑成像評(píng)價(jià)腸系膜微循環(huán)

（2）毛細(xì)血管滲漏

與假手術(shù)組相比，CLP-NaCL組的肺（300[253-452]vs.149[83-152]，p=0.04），腸道（113[88-189]vs.35[21-41]，p=O.009）和肝臟（70[50-89]vs.18[15-26]，p=o.02）的伊文思藍(lán)擴(kuò)散增加（圖2）。心臟沒(méi)有觀察到差異。相反，在CLP大鼠中，與NaCl相比，HSL導(dǎo)致肺（94[78-136]vs.300[253-452]，p=0.006）、腸道（37[31-43]vs.113[88-189]，p=0.03）和肝臟（24[14-37]vs.70[50-89]，p=0.04）的伊文思藍(lán)擴(kuò)散減少，但心臟沒(méi)有。同樣，HSL與NaCl相比顯著改善了流體平衡(? 1.5 [? 1.7至? 0.7]vs.2.0[1.6–2.2]mL/kg/h，p=0.002），HSL大鼠的尿量顯著較高（3.9[3.2–4.1]vs.0.3[0.3–0.8]mL/千克/h，p=0.008）（兩組的輸液量均為2.5 mL/kg/h，如“材料和方法”一節(jié)所述）。

圖2. 在肺（a）、腸（b）、肝（b）和心臟（d）中使用伊文思藍(lán)測(cè)定法（n=5/組）檢測(cè)毛細(xì)血管滲漏。液體平衡結(jié)果（e）、尿量和輸注液體結(jié)果（f）

（3）超聲心動(dòng)圖

與假手術(shù)組相比，CLP-NaCl組的心臟輸出量減少（0.14[0.01-0.18]對(duì)0.30[0.26-0.34]mL/min/g，p=0.004），盡管左室短縮分?jǐn)?shù)沒(méi)有差異（39[33-52]對(duì)44[41-47]。關(guān)于我們模型中可用的前負(fù)荷靜態(tài)指標(biāo)，CLP-NaCl組與假手術(shù)組相比LVEDD降低（6.2[5.2–7.3]vs.9.4[8.8–9.6]mm，p=0.001），但在E/A二尖瓣血流比方面沒(méi)有觀察到差異（1.3±0.4 vs.1.7±0.5，p=1.2）。

HSL vs.NaCl顯著改善了高心排血量（0.34[0.28–0.43]vs.0.14[0.01–0.18]mL/min/g，p<0.0001）和短縮分?jǐn)?shù)（55[46–73]vs.39[33–52]%，p=0.009）的CLP大鼠的左室收縮功能。未觀察到與預(yù)負(fù)荷靜態(tài)指數(shù)相關(guān)的差異。

圖3 經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖

（4）LV pressure-volume loops

與假手術(shù)相比，CLP-NaCl組平均動(dòng)脈壓、舒張動(dòng)脈壓、系統(tǒng)動(dòng)脈壓和脈搏動(dòng)脈壓降低。壓力描記顯示，由于心室向力性降低，dP/dtmax和LVESP降低。然而，LVESPVR無(wú)差異，表明向力性的改變可能與心臟前負(fù)荷和/或后負(fù)荷的改變有關(guān)。相反，在CLP-NaCl大鼠中，dP/dtmin和LVEDPVR發(fā)生了改變，表明心室順應(yīng)性的改變，與心臟前負(fù)荷無(wú)關(guān)。與NaCl相比，給予HSL不會(huì)導(dǎo)致不同水平的動(dòng)脈血壓，但dP/dtmax更高，LVESPVR無(wú)差異，這表明向力性有所改善，但可能與前負(fù)荷增加有關(guān)。LVEDPVR的降低表明心室順應(yīng)性的改善依賴于心臟前負(fù)荷/后負(fù)荷。在本實(shí)驗(yàn)中，CLP-NaCl與假手術(shù)大鼠之間以及CLP-NaCl與CLP-HSL大鼠之間的血漿滲透壓（摩爾濃度滲透壓，摩爾滲透壓）沒(méi)有變化（表1）。

表1：有創(chuàng)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和壓力-容積回路（n=7/組）

（5）生物學(xué)參數(shù)

結(jié)果如表2所示。在CLP大鼠中，輸注HSL與血漿鈉濃度和尿鈉排泄顯著升高相關(guān)，而血漿氯和鉀降低。ΔNa+，代表輸注期間體內(nèi)鈉的累積，在CLP-HSL和CLP-NaCl組之間沒(méi)有顯著差異。與假手術(shù)組相比，CLP-NaCl中的尿素含量是假手術(shù)組的兩倍，而HSL導(dǎo)致較低的血漿水平。與假手術(shù)組相比，CLP-NaCl組白蛋白減少，但與CLP-HSL組相比沒(méi)有。

關(guān)于代謝，CLP-NaCl組與假手術(shù)組相比，血糖降低了兩倍，血漿3-羥基丁酸減少。相反，與NaCl相比，HSL與較高的血糖、乳酸、丙酮酸和3-羥基丁酸的血漿水平相關(guān)，但兩組之間乳酸/丙酮酸比率沒(méi)有差異。

（6）炎癥

與假手術(shù)組相比，CLP-NaCl組炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞因子IL-1β、TNFα和IL-10顯著升高（圖4，表2）。與NaCl相比，HSL降低了血漿中IL-1β、TNFα和IL-10的水平。

假手術(shù)組、CLP-NaCl組和CLP-HSL組之間的VEGF-A或syndecan-1無(wú)差異，但CLP-NaCl組與CLP-HSL組之間的VEGF-A水平降低。

總結(jié)：總之，在實(shí)驗(yàn)性膿毒癥模型中使用高滲乳酸液體可以改善微循環(huán)、毛細(xì)血管滲漏以及心臟和腎臟功能，可能通過(guò)代謝和炎癥途徑實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)和臨床研究都有必要深化HSL改善膿毒癥的機(jī)制，以及可能轉(zhuǎn)移到臨床膿毒癥的治療上。